Thứ Sáu, 21 tháng 2, 2014
Xây dựng quy trình biến nạp đoạn ADN vào tế bào vi khuẩn Ecoli DH5a
5
ngắn giàu A/T, đƣợc sắp xếp trong một khung đọc đặc trƣng và lynh động dọc theo sợi
xoắn DNA. Phân tích footfrinting các gốc hydroxyl của ComK bám vào addAB
promoter cho phép họ kết luận rằng ComK bám vào vùng trình tự giàu A/T
AAAAN
5
TTTT.
ComK đƣợc điều hoà âm bởi sự bám vào của AbrB và CodY, đƣợc hoạt hoá dƣơng
bởi AbrB, sinR, DegU. CodY là một GTP-binding protein nhạy cảm với nồng độ GTP
nội bào nhƣ là một chỉ thị về dinh dƣỡng, nó điều hoà sự phiên mã ở phần đầu phare
ổn định và sự phiên mã của gen quy định sự hình thành bào tử. Từ đó, cho phép tế bào
thích nghi với những giới hạn về dinh dƣỡng. DegU giúp cho ComK bám chặt hơn vào
ComK promoter, điều này đảm bảo sự phiên mã chính xác ngay cả khi nồng độ ComK
thấp.
2.3 Sự biến nạp nhân tạo vào tế bào E.coly
2.3.1 Khái niệm sự biến nạp nhân tạo.
Biến nạp nhân tạo là việc đƣa một đoạn DNA vào tế bào chủ nhằm nhân nhanh số
lƣợng bản sao, phục vụ cho mục đích nghiên cứu khác.
Trong phòng thí nghiệm, nhằm mục đích tăng cƣờng khả năng biến nạp, ngƣời ta
thƣờng xử lý tế bào chủ bằng các phƣơng pháp hóa học hay vật lý. Tế bào chủ sau khi
đƣợc xử lý bằng các phƣơng pháp trên gọi là tế bào khả nạp. Tế bào E.coly là một tế
bào chủ đƣợc sử dụng rộng rãi vì cấu trúc di truyền của nó tƣơng đối đơn giản, thông
tin di truyền đã đƣợc biết tƣờng tận nên dễ dàng phát hiện tế bào có mang gen lạ.
E.coly là một vi khuẩn Gram âm, hình que, dài khoảng 2,5µm, có roi (flagella) và
bộ gen gồm 4639221 cặp base mã hoá cho ít nhất 4000 gen. Giống nhƣ tất cả các loài
vi khuẩn gram âm khác E.coly không có màng nhân và nhiễm sắc thể là một phân tử
sợi đôi dạng vòng rất lớn với những vị trí gắn màng và một vị trí khởi đầu sao chép.
Các tế bào E.coly có thể hỗ trợ sự sao chép các plasmid DNA và chọn lọc các DNA
plasmid tái tổ hợp thông qua gen kháng kháng sinh hay các phức hợp màu với X-gal.
2.3.2 Sự điều hoà gen của operon Lac ở E.coly
Trong trƣờng hợp có glucose, E.coly tăng trƣởng nhanh chóng. Nếu thay glucose
bằng lactose (β-galactisido-glucose), E.coly ngừng tăng trƣởng và hồi phục sau đó nhờ
tổng hợp đƣợc 3 enzym
Permerase kých thích sự thấm lactose
Acetylase (vai trò chƣa rõ)
6
Β-galactosidase xúc tác sự thuỷ giải lactose thành galactose và glucose
Ba enzym này chỉ đƣợc tổng hợp khi cần để phóng thích glucose từ lactose; chúng
đƣợc cảm ứng bởi lactose. Jacobs và Monod (1961) giải thích sự cảm ứng này qua mô
hình hoạt động của operon Lac (lactose operon). Operon Lac là đoạn DNA chứa:
Ba gen cấu trúc lacZ (mã hoá β- galactosidase), lacY (mã hoá permerase) và lacA
(mã hoá acetylase). Một trình tự nucleotide gọi là promoter (vùng khởi động: P), đánh
dấu điểm khởi đầu sao chép của cả 3 gen. Một trình tự nucleotide gọi là operator (vùng
hoạt động: O) nằm giữa promoter và các gen mã hoá enzym. Operator quyết địmh
RNA polymerase không lyên kết hay lyên kết với promoter và di chuyển dọc theo các
gen (trích dẫn bởi Bùi Trang Việt, 2002).
Hình 2.1 Cấu trúc operon Lac trong vi khuẩn E.coly.
Trích dẫn từ Bài giảng sinh học phân tử, Bùi Trang Việt, 2002.
Ngƣời ta gọi một nhóm gen với các chức năng lyên hệ cùng với promoter và
operator là operon. Operon chỉ có ở procaryote; sự tập hợp các gen trong operon giúp
các gen lyên hệ biểu hiện nhanh chóng (do sự thay đổi môi trƣờng), vì chúng đƣợc
kiểm soát chỉ bởi một “nút đóng mở” duy nhất (đó chính là operator). Trƣớc operon
lacZ là gen điều hoà I, gen này mã hoá repressor, tức protein có vai trò kìm hãm sự
biểu hiện gen. Hoạt động của operon Lac đƣợc chứng minh nhƣ sau:
Khi có glucose (và không có lactose), gen điều hoà I hoạt động (I có promoter
riêng) để tạo ra repressor; repressor nhận biết và lyên kết với operator, cản sự lyên kết
gen điều hoà
Gen điều
hoà
Vùng cấu trúc
gen
của lac operon
cấu trúc
gen của
cấu trúc
gen của
cấu trúc
gen của
7
của RNA polynerase và promoter. Khi có lactose (và không có glucose), lactose lyên
kết với repressor và làm biến đổi hình thể của repressor, do đó repressor không lyên
kết với operator: operon Lac mở, RNA polymerase lyên kết với promoter và trƣợt dài
theo các gen của operon; mRNA (mã hoá cho cả 3 enzym) đƣợc tạo thành và đƣợc
dịch mả thành các polypeptide riêng biệt. Với hỗn hợp glucose và lactose, E.coly dùng
glucose trƣớc, sự dùng lactose bị đàn áp: đó là sự “kìm hãm dị hoá”. Khi glucose
giảm, ngƣời ta chứng minh cAMP gia tăng và cố định trên một protein gọi là CAP
(catabolyte gen activator protein) hay CRP (cAMP recepter protein). phức hợp cAMP-
CAP cố định trên promoter và làm tăng khả năng lyên kết của RNA polymerase với
promoter.
Nhằm duy trì sự tồn tại của các vector bacteriophage trong tế bào chủ, thông
thƣờng E.coly dùng để biến nạp đƣợc cải tiến thành các chủng chủ theo các hƣớng cơ
bản là loại bỏ các hệ thống sửa đổi hạn chế vì các hệ thống này sẽ can thiệp vào sự sao
chép của DNA lạ trong tế bào vi khuẩn khi đó DNA lạ sẽ bị phân giải và thay đổi hoạt
tính endonuclease nhằm làm tăng lƣợng plasmid tích luỹ trong tế bào. Thông thƣờng
ngƣời ta sẽ gây đột biến trên gen endA (endA
-
) là gen mã hóa cho endonuclease I. Việc
mất endonuclease này sẽ làm tăng sản lƣợng plasmid và cải thiện chất lƣợng DNA
chiết tách bằng các phƣơng pháp sinh hoá chuẩn (trích dẫn bởi Bùi Trang Việt, 2002).
2.3.3 Chuẩn bị tế bào khả nạp
Có hai phƣơng pháp chuẩn bị tế bào E.coly khả nạp
2.3.3.1 Phƣơng pháp vật lý
Phƣơng pháp này sử dụng xung điện tác động lên tế bào chủ từ đó gây nên sự thay
đổi trong cấu trúc tế bào và tính thấm ở màng. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là tiến
hành nhanh chóng, tế bào sau xử lý có hiệu suất biến nạp cao.
2.3.3.2 Phƣơng pháp hoá học
Là phƣơng pháp sử dụng hoá chất xử lý tế bào (có thể kết hợp với nhiệt độ).
Phƣơng pháp này thực hiện lâu, hệ số biến nạp của tế bào sau xử lý thấp nhƣng đơn
giản và dễ thực hiện.
Hiện nay để tạo tế bào E.coly khả nạp theo các phƣơng pháp hóa học, ngƣời ta có
thể tiến hành theo 3 cách khác nhau
Thứ nhất, phƣơng pháp Hanahan cho phép tạo những tế bào E.coly khả nạp có hiệu
quả biến nạp cao (5x10
8
khuẩn lạc/µg plasmid DNA).
8
Thứ hai, phƣơng pháp Inoue dễ lặp lại hơn phƣơng pháp Hanahan và tạo ra các tế
bào khả nạp có hiệu quả biến nạp từ 1x10
8
đến 3x10
8
khuẩn lạc/µg plasmid DNA.
Thứ ba, phƣơng pháp Calcium chloride, phƣơng pháp này đƣợc phát triển từ hơn 30
năm qua và tạo ra các tế bào khả nạp có hiệu quả biến nạp từ 5x10
6
đến 2x10
7
khuẩn
lạc/µg plasmid DNA. Thông thƣờng, ngƣời ta xử lý tế bào vi khuẩn trong dung dịch
muối lạnh của kim loại hoá trị II nhƣ CaCl
2
, MgCl
2
, RbCl
2
.
Việc biến nạp DNA plasmid vào E.coly đạt hiệu quả cao hơn khi có sự hiện diện
của ion Ca
2+
ở nhiệt độ thấp (0-4
o
C). Ion Ca
2+
có thể gây ra những xáo trộn trên màng
tế bào làm cho DNA xâm nhập tế bào E.coly dễ dàng hơn. Giai đọan sốc nhiệt kế tiếp
để kých thích sự chuyển của phân tử DNA vào trong tế bào, môi trƣờng dƣỡng chất
đƣợc thêm vào sau đó cho phép tế bào phục hồi và DNA tiến hành sao mã, dịch mã để
tạo ra các protein tƣơng ứng.
2.3.4 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp
Sau khi xâm nhập, plasmid tái bản và thể hiện gen kháng kháng sinh trong tế bào
chủ. Điều này giúp tế bào chủ có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng có kháng sinh.
Do đó, khi trải E.coly biến nạp lên môi trƣờng chứa kháng sinh, chỉ tế bào nào đã thu
nhận plasmid và biểu hiện gen kháng kháng sinh mới có thể sinh trƣởng. Các tế bào
không tiếp nhận plasmid sẽ không sinh trƣởng đƣợc.
Tuy vậy, kết quả của phản ứng nối giữa đoạn DNA và vector đã đƣợc mở vòng là
một tổ hợp bao gồm nhiều kết quả nối, đó là vector-vector, vector-DNA chèn. Do vậy,
có những thể biến nạp có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng chứa kháng sinh
nhƣng không mang gen mục tiêu. Việc sàng lọc các thể biến nạp mang gen mục tiêu
đƣợc tiến hành theo nhiều phƣơng pháp. Phổ biến là các phƣơng pháp sau:
Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp dựa trên việc quan sát màu xanh
hay trắng của khuẩn lạc bằng α-complementation.
Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp bằng phƣơng pháp lai (lai khuẩn lạc).
Xác định gen đích trên plasmid trong thể biến nạp bằng PCR (PCR khuẩn lạc).
Thông thƣờng, để phân tích một dòng ngƣời ta dung hai phƣơng pháp là khảo sát
plasmid tái tổ hợp bằng cách tạo bản đồ cắt giới hạn và giải trình tự toàn bộ đoạn gen đích.
Nhiều plasmid vector (ví dụ họ pUC, pBluescript, pGem và các plasmid có nguồn
gốc từ các họ plasmid này) mang một đoạn ngắn của DNA E.coly chứa những trình tự
điều hòa và mã hóa cho α-protein của β-galactosidase (đầu amin). Việc chèn vào đoạn
9
này trình tự MCS chứa các vị trí cắt giới hạn duy nhất (vẫn duy trì khung đọc) sẽ tạo
thêm vài amino axit trong α-protein mà không ảnh hƣởng tới chức năng của lacZ. Các
vector loại này sẽ đƣợc sử dụng với các chủng chủ thể hiện phần đầu carboxyl của β-
galactosidase. Hiện tƣợng α-complementation xảy ra khi hai protein bất hoạt của β-
galactosidase E.coly (α, ω-protein ) kết hợp với nhau để tạo thành một enzym có chức
năng. Các khuẩn lạc có α-complementation sẽ dễ dàng đƣợc phát hiện vì việc xuất
hiện khuẩn lạc màu xanh trên môi trƣờng có chứa cơ chất tạo màu X-gal (5-Bromo- 4-
chloro-3-Indolyl –β-D-galactopyranoside). Hợp chất không màu X-gal bị phân cắt bởi
β-galactosidase để cho galactose và một dẫn xuất của indoxyl. Dẫn xuất này, đến lƣợt
nó, bị oxy hóa trong không khí để tạo ra dẫn xuất dibromo-dichloro có màu xanh. Để
có sự biểu hiện của β-galactosidase cần có chất kých hoạt là IPTG (đồng phân của
galactose không bị nhận biết bởi β-galactosidase), đóng vai trò nhƣ là chất kých hoạt
của gen lacZ.
Khi chèn đoạn DNA vào trình tự MCS của các vector (ví dụ pBluescript) sẽ làm
ngăn cản việc tạo thành α-protein đầu amin. Do đó, hiện tƣợng α-complementation
không thể xảy ra. Vì vậy, khuẩn lạc do thể biến nạp hình thành có màu trắng.
2.3.5 Chiết tách DNA plasmid
Với mong muốn thu nhận một số lƣợng lớn các bản sao plasmid, ngƣời ta sử dụng
bộ máy di truyền của các tế bào chủ. Thông qua đó, plasmid đƣợc sao chép với số
lƣợng lớn và tốc độ cực kì nhanh chóng theo tốc độ tăng trƣởng của tế bào chủ. Trƣớc
hết, biến nạp plasmid vào tế bào chủ, sau đó nuôi cấy tế bào chủ trên môi trƣờng chọn
lọc thích hợp thu nhận sinh khối tế bào. Quá trình tách chiết plasmid từ tế bào chủ là
công đoạn cuối cùng nhằm thu nhận plasmid dƣới dạng tinh. Các quy trình tách chiết
đều có các bƣớc chính là phá vỡ màng tế bào, biến tính DNA, tủa protein, cuối cùng là
tủa DNA. Tuỳ theo từng phƣơng pháp cụ thể ngƣời ta sẽ sử dụng các tác nhân khác
nhau trong từng công đoạn của quá trình tách chiết.
Có nhiều phƣơng pháp tách chiết plasmid từ tế bào chủ, chẳng hạn nhƣ:
Phƣơng pháp nhiệt độ cao
Phƣơng pháp Lythium
Phƣơng pháp SDS-kiềm
10
2.3.6 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
2.3.6.1 Giới thiệu về phản ứng PCR
Là phản ứng nhân nhanh số lƣợng mẫu DNA nhờ thực hiện cơ chế tự nhân đôi
DNA invitro. Quá trình này đƣợc tiến hành nhờ enzym DNA polymerase.
Phản ứng PCR gồm các bƣớc chủ yếu sau:
Bƣớc 1: Biến tính mẫu DNA thành chuỗi đơn ở nhiệt độ 94-95
o
C
Bƣớc 2: Giai đoạn bắt cặp giữa Primer và mạch khuôn, nhiệt độ bắt cặp tùy thuộc vào
trình tự của Primer, thông thƣờng khoảng 40 – 50
o
C.
Bƣớc 3: Giai đoạn kéo dài tổng hợp bản sao DNA đƣợc tiến hành ở 72
o
C
Mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc trên đƣợc lập lại nhiều lần.
Hình 2.2 Các chu kỳ của phản ứng PCR.
2.3.6.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR
Taq polymerase
Taq polymerase là enzym chính tham gia vào quá trình tổng hợp các mạch DNA.
Enzym này còn có khả năng phân hủy primer bắt cặp vào mạch DNA tạo điều kiện
cho việc bổ sung các nucleotide vào mạch DNA mới. Taq polymerase đƣợc phân lập
từ vi khuẩn suối nƣớc nóng thermus aquaticus. Enzym này có tính chịu nhiệt rất cao,
nó chịu đƣợc nhiệt độ biến tính DNA khoảng 94
o
C. Nhiệt độ tối ƣu cho sự hoạt động
của Taq polymerase khoảng 70 – 72
o
C. Trong phản ứng PCR nếu nồng độ enzym này
quá thấp không đủ lƣợng enzym xúc tác cho phản ứng sẽ tạo ra sản phẩm PCR không
mong muốn.
2 4 6 8 1 0
Biến tính
Ủ bắt cặp
Kéo dài
Lặp lại n lần
94–95
o
C
72
o
C
45-56
o
C
11
Các nucleotid tự do
dNTP – deoxyribonucleotide-5-triphosphate. Đây là hổn hợp 4 loại nucleotide
dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên lyệu cho phản ứng tổng hợp mạch DNA mới.
Nồng độ nucleotide trong phản ứng PCR mất cân bằng sẽ làm phát sinh các lỗi sao
chép của Taq polymerase.
Primer (mồi)
Primer (mồi) là những đoạn olygoribonucleotide mạch đơn có trình tự bổ sung với
trình tự của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA. Chiều dài của
mồi thƣờng từ 10 – 35 nucleotide. Mồi khởi đầu cho quá trình tổng hợp mạch mới. Khi
mồi bắt cặp vào mạch khuôn thì Taq polymerase bắt đầu kéo dài chuỗi DNA.
Dung dịch đệm
Thành phần quan trọng nhất trong dung dịch đệm là ion Mg
2+
. Nó rất cần thiết cho
quá trình lyên kết các dNTP, xúc tác cho enzym Taq polymerase, làm tăng nhiệt độ
nóng chảy của các DNA mạch kép. Nồng độ MgCl
2
tối ƣu là 1.5mM.
Môi trƣờng đệm KCl đã và đang đƣợc áp dụng rộng rãi, cũng có thể là chất đệm
hữu dụng cho phản ứng PCR. Tuy nhiên trong nhiều trƣờng hợp môi trƣờng này
không hiệu quả nên ngƣời ta vẫn lựa chọn sử dụng Mg
2+
. Với những đoạn DNA giàu
G, C ngƣời ta thƣờng dùng dung dịch đệm amonium sulphate nhằm làm giảm những
sản phẩm đƣợc tạo một cách không hoàn toàn trong PCR với Taq . Phƣơng pháp này
dùng phát hiện những đoạn gen có kých thƣớc nhỏ chạy trên gel acrylamide.
DNA khuôn
Phản ứng PCR tối ƣu trên DNA thật tinh sạch. Tuy nhiên có nhiều nghiên cứu cho
thấy PCR vẫn tốt trên DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào, các vết máu, mẫu
khảo cổ, vi khuẩn bị hấp khử trùng…Lƣợng DNA khuôn mẫu sử dụng có khuynh
hƣớng giảm từ 1µg xuống khoảng 100ng nhằm giảm việc tạo các sản phẩm phụ không
mong muốn.
Số chu kỳ phản ứng
Số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR trong thực tế không vƣợt qúa 40 chu kỳ. Số chu kỳ
cho một phản ứng PCR tùy thuộc vào số lƣợng DNA mẫu ban đầu. Nếu ít chu kỳ thì
12
sản phẩm PCR thu đƣợc ít. Nếu kéo dài tiến trình PCR thì hiệu quả khuyếch đại giảm
hẳn do: sự cạn kiệt các thành phần phản ứng, sự mỏi mệt của các enzym dùng trong
phản ứng.
Nhiệt độ và pH
Những enzym đƣợc sử dụng trong phản ứng rất mẫn cảm với nhiệt độ. Theo Trần
Thị Dân (2000), sự thay đổi nhiệt độ có ảnh hƣởng mạnh đến năng suất và độ chuyên
biệt của sản phẩm PCR. Để biến tính thì khoảng nhiệt độ từ 94 – 95
o
C là thích hợp
nhất, nếu nhiệt độ cao hơn sẽ làm mất hoạt lực của Taq polymerase. Để kéo dài chuỗi
ngƣời ta sử dụng nhiệt độ 72
o
C, đây là nhiệt độ tối ƣu cho Taq polymerase hoạt động.
Khoảng nhiệt độ dùng để bắt cặp là khó xác định nhất, khoảng nhiệt độ này đƣợc xác
định tùy từng loại primer. Primer có trình tự càng nhiều G, C thì nhiệt độ bắt cặp càng
cao. Thông thƣờng nhiệt độ bắt cặp từ 50 – 56
o
C.
Hầu hết các enzym, mẫu DNA đƣợc đệm trong môi trƣờng tối ƣu có pH = 8. Ở pH
này DNA rất ổn định. Trong môi trƣờng axit các bazơ purin rất dể bị tách khỏi sợi
DNA, cầu nối phosphodiester bị phá vỡ. Tuy nhiên theo chu kỳ nhiệt độ của phản ứng
PCR thì pH có thể thay đổi từ 6,8 – 7,8.
Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục
Bảng 2.1 Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục
1. Có nhiều
sản phẩm
chuỗi ngắn
không đặc
trƣng
Gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp
Gia tăng thời gian ủ bắt cặp
Gia tăng thời gian kéo dài chuỗi
Gia tăng nhiệt độ kéo dài chuỗi lên đến 74 – 78
o
C
Giảm nồng độ KCl buffer đến 0,7 – 0,8 nM, giữ nguyên nồng độ
MgCl
2
ở mức 1,5 – 2 nM.
Gia tăng nồng độ MgCl
2
lên 3 – 4,5 mM, nhƣng giữ nguyên nồng độ
dNTP
Giảm lƣợng mồi
Giảm lƣợng DNA khuôn
Giảm lƣợng tap polymerase
13
2. Có nhiều
sản phẩm
chuỗi dài
không đặc
trƣng
Giảm thời gian ủ bắt cặp
Gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp
Giảm thời gian kéo dài
Giảm nhiệt độ kéo dài xuống còn 62 – 68
o
C
Gia tăng nồng độ KCl buffer lên 1,2 – 2 X, vẫn giữ nồng độ MgCl
2
ở
mức 1,5 – 2 mM
Gia tăng nồng độ MgCl
2
lên 3 – 4,5 nM, nhƣng vẫn giữ nguyên nồng
độ dNTP
Giảm lƣợng mồi
Giảm lƣợng DNA khuôn
Giảm lƣợng Taq polymerase
3. Không có
sản phẩm nào
cả
Đảm bảo rằng các thành phần PCR đã cho vào phản ứng
Đổi dung dịch dNTP do dNTP rất nhạy cảm với việc cấp rã đông.
Gia tăng hàm lƣợng mồi
Gia tăng hàm lƣợng DNA khuôn mẫu
Giảm nhiệt độ bắt cặp xuống 6 – 10
o
C
4. Sản phẩm
PCR ít
Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp đến mức có thể
Gia tăng lƣợng mồi
Gia tăng lƣợng DNA khuôn
Gia tăng lƣợng Taq polymerase
Ứng dụng của PCR
PCR có nhiều ứng dụng trong ngành sinh học. PCR với cặp primer đƣợc thiết kế
riêng sẽ phân lập đƣợc đoạn DNA mong muốn. Từ đây nó đƣợc ứng dụng trong các
lĩnh vực:
Y khoa: dùng chuẩn đoán bệnh do các tác nhân là vi khuẩn hoặc virus.
Nông nghiệp: dùng trong chọn giống và xác định các yếu tố gây bệnh trên cây
trồng. Dùng chuẩn đoán bệnh trong công tác chăn nuôi, chọn giống. Dùng phát hiện ra
các gen dự tuyển về năng suất sinh sản trong chăn nuôi heo nhƣ việc xác định gen thụ
thể estrogen, gen halothan, gen thụ thể prolactin
14
Thực phẩm: Xác định các tác nhân gây bệnh do vi khuẩn hoặc vi rút có trong mẫu thực
phẩm. Sử dụng để xác nhận sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hay là sản phẩm chuyển gen.
2.3.7 Điện di DNA
Phƣơng pháp điện di là phƣơng pháp cho phép xác định kých thƣớc của các đoạn
DNA. DNA đƣợc cho vào một bản gel agarose và đặt trong điện trƣờng. Do DNA tích
điện âm nên trong môi trƣờng điện trƣờng nó sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng.
Agarose là một trong các dạng của polysacharide. Agarose sẽ tạo thành hạt agarose
sau khi tan (melting) ở nhiệt độ cao, hoặc đun sôi vài phút. Khi nguội lại những hạt
agarose sẽ kết tụ lại với nhau (gellyng). Giữa những hạt nhƣ vậy có những lổ rất nhỏ.
Tùy theo nồng độ của gel mà kých thƣớc của các lỗ nhỏ này khác nhau. Nồng độ gel
càng cao thì kých thƣớc của các lổ càng nhỏ và ngƣợc lại. Khi DNA đi qua các lổ nhỏ
này sự cọ sát giữa các hạt agarose và phân tử DNA tạo lực trở kháng làm ngăn cản sự
dịch chuyển này. DNA có kých thƣớc càng lớn thì lực trở kháng càng mạnh do đó sự
di chuyển càng chậm và ngƣợc lại. Các DNA cùng kých thƣớc sẽ di chuyển về cùng vị
trí và tạo thành các băng, các băng này có thể quan sát đƣợc sau khi nhuộm chúng
trong dung dịch ethium bromide và chiếu dƣới tia tử ngoại.
2.4 Vector, công cụ biến nạp DNA
Khái niệm về vector
Vector là vật lyệu quan trọng trong các thí nghiệm biến nạp DNA, thí nghiệm gen
cloning. Vector đƣợc chọn phải có khả năng mang một hoặc nhiều gen vào tế bào chủ
và cần có các đặc điểm tiêu chuẩn nhƣ sau:
Có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ, sao chép không phụ thuộc sự sao chép
bộ gen tế bào chủ. Có những đặc tính cho phép phát hiện dễ dàng tế bào vi khuẩn có
chứa chúng. Các đặc tính này thƣờng đƣợc mã hoá bởi các gen chọn lọc. Mang những
vị trí nhận biết duy nhất của một số enzym giới hạn. Các vị trí cắt giới hạn này có tác
dụng mở rộng khả năng xây dựng vector tái tổ hợp từ vector ban đầu. Có kých thƣớc
càng nhỏ càng tốt để có thể thu nhận một lƣợng DNA tối đa. Hơn nữa, kých thƣớc
vector càng nhỏ thì càng dễ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, càng đƣợc sao chép nhanh
và hiểu quả. Tồn tại đƣợc trong tế bào vi khuẩn qua nhiều thế hệ và ít gây xáo trộn
nhất cho tế bào chủ. Các vector biểu hiện cần chứa thêm promoter thích hợp cho việc
biểu hiện gen trong sinh vật chủ.
Đăng ký:
Đăng Nhận xét (Atom)
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét